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ライフサイエンス統合データベースセンター 内藤 雄樹

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RSR☆ ダウンサス Ti2000 スペイド NCP145 1台分セット 新品 RSR T421TW

  • 2011-08-04 (木) 11:25
  • DBCLS

GGRNAの売りのひとつは塩基配列やアミノ酸配列を素早く検索できることです。今回の記事ではGGRNAの検索事例を「塩基配列編」「アミノ酸配列編」に分けて紹介します。まずは「塩基配列編」。

(8/9 追記)「アミノ酸配列編」も公開しました。

RSR☆ 2008年04月~ ダウンサス Ti2000 スペイド NCP145 1台分セット GRS210/GRS211/AWS210/AWS211 新品 RSR T421TW

「論文のマテメソに記載のプライマーをそのまま利用してPCRをかけたい」とか、「過去に設計したプライマーの増幅領域がわからなくなったので確認したい」ということはありませんか。たとえばプライマー配列が

forward primer: CTAGCTGCCAAAGAAGGACAT
reverse primer: CAATGAGATGTTGTCGTGCTC

の場合、「CTAGCTGCCAAAGAAGGACAT  comp:CAATGAGATGTTGTCGTGCTC」で検索します(→GGRNAで検索)。reverse primerは逆向きに設計されているので、相補鎖検索のオプションである comp: タグをつけることがポイントです。

上の例では、NFκBの2つのtranscript variant(NM_001165412.1, NM_003998.3)がヒットしました。1件目(NM_001165412.1)から見ていくと、塩基配列が緑にハイライトされている場所のすぐ下に、position 2328 2547とあり、2つのプライマー配列がマッチしたそれぞれの場所の、先頭の塩基の位置を示しています。これを元にPCR産物のサイズを計算すると、2547 – 2328 + 21 = 240 (bp) となります。21はreverse primerの長さです。なお、

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、positionの右に (CDS: 468 – 3374) とあるのはCDSの範囲を示しています。今回のプライマーがどちらもCDS内に設計されていることがわかります。

2件目(NM_003998.3)も同様にPCR産物のサイズを計算すると 2550 – 2331 + 21 = 240 (bp) となります。NFκBのもう1つのtranscript variantですが、1件目と同じ長さの断片が増幅すると考えられます。

プライマーがマッチしている場所を詳しく見てみましょう。1件目のタイトル部分、「Homo sapiens nuclear factor of kappa …」をクリックするとその転写産物の詳細が表示され、さきほど検索したプライマー配列がどこにマッチしているかわかります。

ちなみに、従来からあるサービスではUCSC In-Silico PCRが有名ですが、こちらで調べるとヒットするのは1件、PCR産物のサイズは692bpとなり、GGRNAと異なる結果になります。

この違いは、UCSCのサービスがゲノムを検索するのに対して、GGRNAは転写産物を検索していることによるものです。上記のNFκBのプライマーは452bpのイントロンを跨ぐようにデザインされたているため、ゲノムから増やすと 240 + 452 = 692 (bp) の長さになるというわけです。余談ですが、RT-PCRではこのようにイントロンを跨ぐように設計されたプライマーを用いると、ゲノムDNAがコンタミして増幅した場合にサイズの異なるバンドが出現するので容易に区別することができます。

Figureに出てくる塩基配列の断片を検索

論文のfigureなどに出てくる塩基配列をさっと探すのにも使えます。

Rajewsky et al. microRNA target predictions in animals. Nature Genetics 38, S8 – S13 (2006) より引用

左側のRNA鎖は、マウスmiR-375の標的サイト、myotrophinの3′ UTRの配列の一部です。GGRNAでMus musculus (mouse)を選択してとりあえず配列の一部「GUUGCAAGA」を検索してみます(→GGRNAで検索)。これでは322件もヒットするので、もうすこし伸ばして「GUUGCAAGAACAAA」で検索すると(→GGRNAで検索)、1件に絞り込めます。なお、GGRNAはUとTを同一視して塩基配列を検索します。

ヒットしている位置が3763でCDSの範囲が279 – 635なので、3′ UTRのかなり後ろのほうだとわかります。

ちなみに右側のmiR-375の配列も カードでポイント最大34倍 3/21(木)20:00~3/26(火)1:59迄 TOYOTIRES トーヨー プロクセス C1S PROXES サマータイヤ 215/60R16 ブリヂストン ECOFORM エコフォルム CRS12 ホイールセット 4本 16インチ 16 X 6.5 +38 5穴 114.3、「UUUGUUCGUUCGG」と13文字程度入力すれば出てきます(→GGRNAで検索)。

次の例。

Yekta et al. MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science 304, 594-596 (2004) より引用

ヒト、マウス、ラット等どれでもよいのですが、黒くなっている部分「CCAACAACAUGAAACUGCCUA」を検索すると(→GGRNAで検索)、HOXB8 (NM_024016.3) の position 1379 (CDS: 236 – 967) がヒットして、確かに3′ UTRにマッチしていることを確認できました。

なお、検索したい事例にあわせて、相補鎖を検索する comp: というタグや、両方の鎖を検索する both: 、1〜3塩基のミスマッチを許して検索する seq1:, seq2:, seq3: も適宜ご利用ください。

siRNAのオフターゲット遺伝子の検索

哺乳類細胞でRNAiをおこなう際には 【クスコ CUSCO】クラウン 等にお勧め パワーブレース 型式等:GRS210 品番:199 492 R、長さが21塩基の短い2本鎖RNAである「siRNA」がよく利用されますが、siRNAの配列が標的以外の無関係な遺伝子と似ていると、誤ってそれらを抑制してしまう可能性があります(siRNAのオフターゲット効果)。mesoが東大在職時に公開したsiRNA設計サイト「siDirect」では、設計したsiRNAの配列(正確には、ガイド鎖の5’末端から数えて2〜20の位置の19-mer)を相同性検索にかけ、3ミスマッチ以内で相同な遺伝子のリストを表示する機能を提供しています。余談ですが、なぜ全長(1〜21)ではなく2〜20かというと、RNAiが起こる際にガイド鎖の5’末端の塩基はArgonauteタンパクのMidドメインのポケットに入っており、また3’末端の塩基はPAZドメインに結合しているため、それぞれ標的の認識に寄与しないと考えられるためです。なお、ミスマッチがどの程度あれば安全なのかはハッキリとは決まっていないのですが、1ミスマッチだとオフターゲット効果が起こる可能性が十分にあり、ミスマッチが多くなるほどそのリスクは減っていく傾向があります。一方、バイオインフォ的な解析からは、siRNAの本来の標的以外のすべての遺伝子に対して必ず3ミスマッチ以上を保証できるような配列は全体の10%程度設計できますが、4ミスマッチ以上を保証できる配列はほとんど設計できないことがわかっています。

ここでは、GGRNAを使って下記のsiRNAと相同性の高い遺伝子を探してみます。なお、このsiRNAはclaudin 17という遺伝子を標的に設計されたものです。

siRNAのガイド鎖 5′-UAGAACUUGCAUUGCAACCGG-3′ の両末端を除いた 5′-AGAACUUGCAUUGCAACCG-3′ とハイブリダイズする配列をさがしたいので、まずは「comp:AGAACUUGCAUUGCAACCG」を検索してみます(→GGRNAで検索)。

ヒットは1件、このsiRNAの本来の標的遺伝子であるclaudin 17 (CLDN17; NM_012131.2) が表示されています。続いてミスマッチを許して検索するオプションをつけて検索していきます。

{yahoojp}jpprem01-zenjp40-wl-zd-16727